เรียบเรียงโดย Peter Sarnow คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด มหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด แคลิฟอร์เนีย อนุมัติเมื่อวันที่ 25 ธันวาคม 2020 (ตรวจสอบเมื่อวันที่ 25 ตุลาคม 2020)
เรารายงานปฏิสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยในการจำลองแบบของคอมเพล็กซ์การถอดรหัสโคโรนาไวรัส ซึ่งจำเป็นสำหรับการจำลองแบบและการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการเราแสดงหลักฐานว่าโดเมน NiRAN ที่เกี่ยวข้องกับ nsp12 มีกิจกรรมการถ่ายโอนนิวคลีโอไซด์โมโนฟอสเฟต (NMP) ในทรานส์ และระบุ nsp9 (โปรตีนที่มีผลผูกพัน RNA) เป็นเป้าหมายNiRAN เร่งปฏิกิริยาการเกาะติดโควาเลนต์ของมอยอิตี NMP กับปลายทางอะมิโน nsp9 ที่ได้รับการอนุรักษ์ในปฏิกิริยาที่อาศัยไอออน Mn2+ และสารตกค้าง Asn อนุรักษ์ที่อยู่ติดกันพบว่ากิจกรรมของ NiRAN และ nsp9 NMPylation มีความจำเป็นต่อการจำลองแบบของไวรัสโคโรนาข้อมูลช่วยให้เราสามารถเชื่อมโยงกิจกรรมของเครื่องหมายของเอนไซม์ไวรัสที่ซ้อนกันกับการสังเกตก่อนหน้านี้ในสมมติฐานที่ว่าการเริ่มต้นการสังเคราะห์ RNA ในคลาสของไวรัส RNA นั้นมีความสอดคล้องเชิงหน้าที่และวิวัฒนาการ
RNA-based RNA polymerase (RdRps) ของ Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae และอีก 12 ตระกูล) เชื่อมโยงกับโดเมนอะมิโนเทอร์มินัล (N-terminal) ในโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง (nsp) ที่ปล่อยออกมาจากโพลีโปรตีนที่เรียกว่า NiRAN 1ab ประกอบด้วยโปรตีเอสหลักของไวรัส (Mpro)ก่อนหน้านี้ มีการรายงานกิจกรรม GMPylation/UMPylation ของไวรัสหลอดเลือดแดง NiRAN-Rp nsp และแนะนำให้สร้างชั่วคราวสำหรับการถ่ายโอนนิวคลีโอไซด์โมโนฟอสเฟต (NMP) ไปยังไวรัส (ไม่ทราบในปัจจุบัน) และ/หรือกระบวนการทางชีวภาพของเซลล์ที่นี่ เราแสดงให้เห็นว่าไวรัสโคโรนา (ไวรัสโคโรน่าของมนุษย์ [HCoV]-229E และโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) มีกิจกรรม NMPylation ที่ขึ้นกับ Mn2+ ซึ่งได้มาจาก nsp9 ผ่านการก่อตัวของ Mpro-mediated nsp9 After nsps ที่ขนาบข้าง N-terminal จะถูกปล่อยออกมาโปรตีโอไลต์, phosphoramidate ถูกผูกมัดกับเอมีนปฐมภูมิ (N3825) ที่ N-terminal ของ nsp9ยูริดีน ไตรฟอสเฟตเป็นนิวคลีโอไทด์ที่ต้องการในปฏิกิริยานี้ แต่อะดีโนซีน ไตรฟอสเฟต, กัวโนซีน ไตรฟอสเฟต และไซติดีน ไตรฟอสเฟต ก็เป็นสารตั้งต้นร่วมที่เหมาะสมเช่นกันการศึกษาการกลายพันธุ์โดยใช้โปรตีน recombinant coronavirus nsp9 และ nsp12 และการกลายพันธุ์ HCoV-229E ที่ดัดแปลงพันธุกรรม กำหนดสิ่งตกค้างที่จำเป็นสำหรับ NiRAN-mediated nsp9 NMPylation และการจำลองไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ข้อมูลยืนยันการทำนายสารตกค้างของไซต์ที่ใช้งานของ NiRAN และกำหนดบทบาทที่สำคัญของสารตกค้าง nsp9 N3826 ใน nsp9 NMPylation และการจำลองแบบของไวรัส ในหลอดทดลองสารตกค้างนี้เป็นส่วนหนึ่งของลำดับไตรเปปไทด์ N-terminal NNE ที่ได้รับการอนุรักษ์ และได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นสารตกค้างที่ไม่แปรเปลี่ยนเพียงชนิดเดียวของ nsp9 และความคล้ายคลึงกันในตระกูลโคโรนาไวรัสการศึกษาครั้งนี้เป็นรากฐานที่มั่นคงสำหรับการศึกษาการทำงานของกิจกรรม NMPylation ของไวรัสที่ซ้อนกันอื่นๆ และเสนอเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการพัฒนายาต้านไวรัส
ไวรัส RNA ที่ติดเชื้อไวรัส Nidovirales ติดเชื้อในสัตว์มีกระดูกสันหลังและสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหลายชนิด (1, 2)ปัจจุบันคำสั่งดังกล่าวประกอบด้วย 14 ตระกูล (3) ซึ่งมีการศึกษาตระกูลโคโรนาไวรัสอย่างกว้างขวางในช่วง 20 ปีที่ผ่านมาในเวลานั้น โคโรนาไวรัสจากสัตว์สู่คน 3 ชนิดเกิดจากสัตว์อาศัย และทำให้เกิดการระบาดของการติดเชื้อทางเดินหายใจรุนแรงในมนุษย์ในวงกว้างรวมถึงโรคระบาดต่อเนื่องที่เกิดจากโรคติดเชื้อเฉียบพลันรุนแรงโรคระบบทางเดินหายใจโคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)Nidoviruses มีโครงสร้างจีโนมร่วมกัน และหน่วยย่อยของการจำลองแบบที่ผูกกับเมมเบรน (RTC) จะถูกเข้ารหัสในเทอร์มินัล 5-?² สองในสามและหน่วยย่อยโครงสร้างหลักของอนุภาคไวรัส รวมถึงอุปกรณ์เสริมบางอย่าง .โปรตีน เข้ารหัสใน 3??² ปลายส่วนที่สามของจีโนม (1)ยกเว้นไวรัสพลานาเรียตระกูลหนึ่ง (Monoviridae) (8) ไวรัสที่ซ้อนกันทั้งหมดเข้ารหัสหน่วยย่อย RTC ในสองเฟรมการอ่านแบบเปิดขนาดใหญ่ (ORF) ORF1a และ ORF1b ซึ่งแปลจากจีโนม RNA ของORF1a เข้ารหัสโพลีโปรตีน (pp) 1a และ ORF1a และ ORF1b ร่วมกันเข้ารหัส pp1abด้วยการมีส่วนร่วมโดยทั่วไปของโปรตีเอสหลัก (Mpro) ที่เข้ารหัสโดย ORF1a ทั้ง pp1a และ pp1ab จะถูกแปรรูปเชิงโปรตีนเป็นโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง (nsps) หลากหลายชนิดหรือที่เรียกว่า 3CLpro เนื่องจากมีความคล้ายคลึงกับ 3Cpro ของ picornavirus ( 9)nsps เหล่านี้คิดว่าจะประกอบเป็น RTC ไดนามิกขนาดใหญ่ กระตุ้นการสังเคราะห์จีโนม RNA (การจำลอง) และชุดของ RNA ย่อยของจีโนม (การถอดความ) และใช้เพื่อประสานงานการแสดงออกของ ORF ที่อยู่ปลายน้ำของ ORF1b (10? ? ?12)
RTC หลักประกอบด้วย RNA-based RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) และเอนไซม์ประมวลผล RNA หลายตัว ซึ่งส่วนใหญ่เข้ารหัสใน ORF1b และในตระกูลโคโรนาไวรัส ประกอบด้วย nsp12-nsp16 และ nsp9-nsp12 ในตระกูล Arterioviridae (ดูอ้างอิง 10ââ 12)RdRp และ HEL1 เป็นตัวแทนของโดเมนที่ได้รับการอนุรักษ์สอง (หนึ่งในห้า) ของไวรัสรังนก และมีความคล้ายคลึงกับไวรัส RNA อื่นๆเชื่อกันว่าการจำลองหลักจะได้รับความช่วยเหลือจากหน่วยย่อยอื่น รวมถึง nsps ขนาดเล็กหลายตัวที่ปล่อยออกมาจากบริเวณคาร์บอกซีเทอร์มินัล (เทอร์มินัล C) ของ pp1a ดาวน์สตรีมของ Mpro (coronavirus nsp5 และ arterial virus nsp4 ตามลำดับ)พวกเขามีการคุ้มครองเฉพาะครอบครัวที่จำกัดและกิจกรรมที่หลากหลาย (ทบทวนในอ้างอิง 10ââ12)
เมื่อไม่นานมานี้ โดเมนที่มีลักษณะเฉพาะของลำดับแม่ลายถูกพบที่ปลายทางอะมิโน (N-terminus) ที่อยู่ติดกับ RdRp ในไวรัสที่ซ้อนกันทั้งหมด แต่ไม่มีไวรัส RNA อื่น ๆ (16)ขึ้นอยู่กับตำแหน่งของมันและกิจกรรมการถ่ายโอนนิวคลีโอไทด์ (นิวคลีโอไซด์โมโนฟอสเฟต [NMP] ทรานสเฟอเรส) โดเมนนี้มีชื่อว่า NiRAN (การถ่ายโอนนิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับ Nestvirus RdRp)การรวมกันของโดเมนคู่ของ NiRAN-RdRp ถือเป็น nsp12 ในตระกูล Coronaviridae และ nsp9 ในตระกูล Arterioviridae และใน Nestoviridae อื่น ๆ NiRAN-RdRp คาดว่าจะได้รับการปล่อยตัวในฐานะ nsp อิสระจาก polyprotein ของไวรัสในไวรัสโคโรนา โดเมน NiRAN มีสารตกค้าง ??1/450 และเชื่อมต่อกับโดเมน RdRp ของเทอร์มินัล C ผ่านขอบเขตตัวเชื่อมโยง (16?19)ใน Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) recombinant nsp9 แสดงกิจกรรม UMPylation และ GMPylation ที่ขึ้นกับไอออน Mn2+ (ตนเอง) ซึ่งขึ้นอยู่กับฐานลำดับที่อนุรักษ์ไว้สามฐานใน Nestovirus, AN, BN และ CN สิ่งตกค้างในลำดับโดยที่ N ย่อมาจาก NiRAN) (16)การขนาบข้างของเทอร์มินัล N ของลวดลายเหล่านี้ถือเป็นมาตรฐาน preAN ที่อนุรักษ์นิยมน้อยกว่าสารตกค้างเหล่านี้บางส่วนยังได้รับการอนุรักษ์ไว้ในไคเนสโปรตีนที่เกี่ยวข้องกันซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการจับตัวของนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (NTP) และการเร่งปฏิกิริยา (20, 21)เพื่อให้สอดคล้องกับข้อสังเกตนี้ สารตกค้างจากไซต์ออกฤทธิ์ที่สำคัญหลายตัวใน pseudokinase SelO จาก Pseudomonas syringae สามารถประกอบเข้ากับซูเปอร์คอมเพล็กซ์ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ที่เผยแพร่เมื่อเร็วๆ นี้สารตกค้าง NiRAN ของไวรัสโคโรนาที่อนุรักษ์ไว้ซ้อนทับในโครงสร้างจุลภาคของอิเล็กตรอนโปรตีนรีคอมบิแนนท์ (17)มีการคาดเดาว่า U/GMPylation ที่จัดทำเอกสารไว้จะสร้างสถานะชั่วคราวเพื่อถ่ายโอน NMP ไปยังสารตั้งต้น (ไม่ทราบในปัจจุบัน) (16) และความคล้ายคลึงทางโครงสร้างระหว่าง NiRAN และโปรตีนไคเนส (17, 19) เป็นสมมติฐานที่ว่า NiRAN ปรับเปลี่ยนโปรตีนอื่นๆ
คุณสมบัติหลายอย่าง รวมถึงการเชื่อมโยงอย่างเป็นระบบที่เป็นเอกลักษณ์และเป็นเอกลักษณ์กับไวรัสที่ซ้อนกันและการแยกทางพันธุกรรมจาก RdRp ทำให้ NiRAN เป็นเอนไซม์ควบคุมหลักที่เหมาะสมสำหรับไวรัสที่ซ้อนกัน ซึ่งมีความสำคัญต่อการเกิดขึ้นและเอกลักษณ์ของพวกมันก่อนหน้านี้ มีการเรียกฟังก์ชันที่เป็นไปได้สามฟังก์ชันที่เกี่ยวข้องกับ NiRAN เพื่อควบคุมการแปลจีโนม / ย่อยจีโนม หรือการจำลอง / การถอดความเมื่อพิจารณาข้อมูลที่หายากและไม่สมบูรณ์ที่มีอยู่ในขณะนั้น แต่ละฟังก์ชันก็มีข้อดีและข้อเสียของตัวเอง (16)ในการวิจัยนี้ เรามุ่งหวังที่จะผสมผสานการศึกษาทางชีวเคมีและพันธุกรรมแบบย้อนกลับของไวรัสโคโรนาที่เป็นตัวแทนของทั้งสองสกุล และนำการค้นพบของเราไปไว้ในภูมิหลังทางวิวัฒนาการของการกลายพันธุ์ตามธรรมชาติของตระกูลไวรัสโคโรนา เพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับอาณาจักรอันลึกลับนี้เรารายงานความก้าวหน้าที่สำคัญในการทำความเข้าใจ NiRAN ผ่านการระบุเป้าหมายตามธรรมชาติใน RTC ซึ่ง (ในสามสมมติฐานที่มีอยู่) มีส่วนทำให้บทบาทของโดเมนนี้ในการเริ่มต้นการสังเคราะห์ RNA ของไวรัสที่ซ้อนกันงานวิจัยนี้ยังเปิดโอกาสสำหรับบทบาทอื่นๆ ของ NiRAN บนอินเทอร์เฟซโฮสต์ของไวรัส
เพื่อระบุคุณลักษณะของเอนไซม์ของโดเมน NiRAN ที่เกี่ยวข้องกับไวรัสโคโรนา nsp12 เราได้ผลิตรูปแบบรีคอมบิแนนต์ของไวรัสโคโรนา 229E (HCoV-229E) nsp12 ของมนุษย์ในรูปแบบรีคอมบิแนนท์ใน E. coli โดยมีแท็ก His6 ที่ปลายทาง C และรวม โปรตีนที่มี [α32-P ] บ่มร่วมกับ NTP โดยมี MnCl2 ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาบ่งชี้ว่ามีโปรตีนที่ติดฉลากกัมมันตภาพรังสีซึ่งเคลื่อนที่ร่วมกับ nsp12 (106 kDa) ซึ่งบ่งชี้ว่าไวรัสโคโรนา nsp12 เร่งการก่อตัวของสารเกาะติดโปรตีนโควาเลนต์-NMP ซึ่งเกิดขึ้นเป็นพิเศษด้วยยูริดีน โมโนฟอสเฟต (UMP) (รูปที่ 1A) และ ข).การวิเคราะห์เชิงปริมาณแสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับนิวคลีโอไทด์อื่น ความเข้มของสัญญาณของการรวมตัวกันของ UMP เพิ่มขึ้น 2 ถึง 3 เท่า (รูปที่ 1C)ข้อมูลนี้สอดคล้องกับกิจกรรมการถ่ายโอน NMP ที่คาดการณ์ไว้ของโดเมน NiRAN ของโคโรนาไวรัส (16) แต่บ่งชี้ว่าการตั้งค่านิวคลีโอไทด์ของโดเมน NiRAN ของโคโรนาไวรัสและไวรัสหลอดเลือดแตกต่างกัน
กิจกรรม Self-NMPylation ของ HCoV-229E nsp12( A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ถูกบ่มด้วย [α-32P] NTP ที่กำหนดต่อหน้า 6 mM MnCl2 เป็นเวลา 30 นาที (ดูวัสดุและวิธีการสำหรับรายละเอียด)ผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยาถูกแยกโดย SDS-PAGE และย้อมด้วยสีน้ำเงินสดใสของ Coomassie(B) โปรตีนที่มีฉลากกัมมันตรังสีจะถูกมองเห็นโดยการถ่ายภาพฟอสฟอรัสตำแหน่งของ nsp12-His6 และเครื่องหมายมวลโมเลกุลโปรตีน (เป็นกิโลดาลตัน) จะแสดงใน A และ B ( C ) ความเข้มของสัญญาณกัมมันตรังสี (เฉลี่ย ± SEM) ถูกกำหนดจากการทดลองอิสระสามครั้ง*P≤0.05ความแรงของสัญญาณ (เปอร์เซ็นต์) สัมพันธ์กับ UTP
แม้ว่ากิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับ NiRAN ได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีความจำเป็นสำหรับการจำลองแบบของ EAV และ SARS-CoV ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ แต่ฟังก์ชัน NiRAN เฉพาะและเป้าหมายที่เป็นไปได้ยังไม่ได้รับการพิจารณาความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างที่รายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้ระหว่าง NiRAN และตระกูลโปรตีนที่มีรอยพับคล้ายโปรตีนไคเนส (17, 22) กระตุ้นให้เราทดสอบสมมติฐานที่ว่า NiRAN กระตุ้น NMPylation ของโปรตีนอื่น ๆเราสร้างชุดของเป้าหมายที่คล้ายคลึงกันที่เป็นไปได้ รวมถึงโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างที่เข้ารหัสโดย HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) แต่ละอันมีแท็ก C-terminal His6 (ภาคผนวก SI, ตาราง S1) และ บ่มโปรตีนเหล่านี้ด้วย [α32-P] ยูริดีน ไตรฟอสเฟต ([α32-P]UTP) เมื่อมีหรือไม่มี nsp12อัลบูมินในซีรั่มของวัวและโปรตีนฟิวชั่น MBP-LacZα ที่ผลิตใน E. coli ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม (รูปที่ 2A เลน 1 ถึง 7)โปรตีนที่ติดฉลากรังสีได้รับการวิเคราะห์โดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (SDS-PAGE) และการถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติ และพบว่ามีสัญญาณกัมมันตภาพรังสีที่รุนแรงในปฏิกิริยาที่มี nsp12 และ nsp9ตำแหน่งของสัญญาณสอดคล้องกับมวลโมเลกุลของ nsp9 ซึ่งบ่งชี้ถึง UMPylation ที่เป็นสื่อกลางของ nsp12 ของ nsp9 (รูปที่ 2B, แทร็ก 7)ไม่พบโปรตีนทดสอบอื่นๆ ที่เป็น UMPylated ซึ่งทำให้สรุปได้ว่า nsp9 เป็นสารตั้งต้นเฉพาะของ nsp12สอดคล้องกับข้อมูล NMPylation ด้วยตนเองที่แสดงในรูปที่ 1 nsp12 สามารถถ่ายโอน NMP ทั้งสี่ไปยัง nsp9 ได้ แม้ว่าประสิทธิภาพจะแตกต่างกัน UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( รูปภาพ).3 เอ และ ข)ภายใต้เงื่อนไขที่ใช้ในการทดสอบนี้ (ลดระยะเวลาปฏิกิริยาและเวลารับแสง ลดความเข้มข้นของ nsp12 วัสดุและวิธีการ) ไม่สามารถตรวจพบ NMPylation ด้วยตนเองของ nsp12 ได้ (เปรียบเทียบรูปที่ 2B เลน 7 และรูปที่ 1B) ซึ่ง พิสูจน์แล้วว่า UMP มีประสิทธิภาพ (และหลายรอบ) ย้ายจาก nsp12 เป็น nsp9กิจกรรมการถ่ายโอนของ UMP ต้องการการมีอยู่ของ Mn2+ ไอออน ดังแสดงในรูปที่ 3C ในขณะที่กิจกรรมการถ่ายโอนของ UMP เพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่ถูกสังเกตเมื่อมี Mg2+ และไม่มีกิจกรรมใด ๆ เมื่อมีแคตไอออนไดเวเลนต์อีกสองตัวที่ทดสอบข้อมูลที่คล้ายกันได้รับในการตรวจวิเคราะห์ NMPylation ที่ประกอบด้วยไซติดีน ไตรฟอสเฟต (CTP), กัวโนซีน ไตรฟอสเฟต (GTP) และอะดีโนซีน ไตรฟอสเฟต (ATP) (ภาคผนวก SI, รูปที่ S1)
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation ของ nsp9ชุดของสารตั้งต้นโปรตีน (รวมถึงซีรั่มอัลบูมินของวัว, MBP-lacZα และชุดของ HCoV-229E nsps ที่มีป้ายกำกับด้วย C-terminal His6 ที่เข้ารหัสโดย ORF1a) ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินกิจกรรม UMPylation ของ HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated โปรตีน.บ่มโปรตีนด้วย [α-32P] UTP เป็นเวลา 10 นาทีโดยไม่มี (A) หรือมี (B) ของ nsp12 ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการที่ด้านบนของ A และ B จะแสดงเจล SDS-โพลีอะคริลาไมด์ที่ย้อมด้วย Coomassie Brilliant Blue และที่ด้านล่างของ A และ B จะแสดงภาพรังสีอัตโนมัติที่สอดคล้องกันตำแหน่งของเครื่องหมายมวลโมเลกุลโปรตีน (เป็นกิโลดาลตัน) จะแสดงไว้ทางด้านซ้ายตำแหน่งของ nsp12-His6 (B, ด้านบน) และสัญญาณกัมมันตรังสีที่สังเกตได้ในระหว่างการฟักตัวของ nsp12-His6 ด้วย nsp9-His6 (B, เลน 7) ก็ถูกระบุเช่นกัน ซึ่งบ่งชี้ว่า [α-32P]UMP ถึง nsp9-His6 (12.9 kDa) ซึ่งตรวจไม่พบสำหรับโปรตีนอื่นๆ ที่ทดสอบ
HCoV-229E NiRAN เป็นสื่อกลางในการจำแนกลักษณะทางชีวเคมีและไวรัสวิทยาของ nsp9 NMPylation(A และ B) บทบาทของสารตั้งต้นร่วมนิวคลีโอไทด์ที่ใช้ในปฏิกิริยาNsp12-His6 และ nsp9-His6 ถูกผสมและบ่มต่อหน้า [α-32P] NTP ที่แตกต่างกันในการทดสอบ NMPylation มาตรฐาน(A, บนสุด) ย้อม Coomassie nsp9-His6 แยกจากกันโดย SDS-PAGE(A, ล่าง) Autoradiograph ของบริเวณเดียวกันของเจล(B) กิจกรรมสัมพัทธ์ (ค่าเฉลี่ย ± SEM) ต่อหน้าโคแฟกเตอร์นิวคลีโอไทด์ที่กำหนดถูกกำหนดจากการทดลองอิสระสามครั้ง*P≤0.05(C) บทบาทของไอออนของโลหะที่แสดงไว้คือการทดสอบ NMPylation มาตรฐานโดยมี [α-32P] UTP และไอออนของโลหะที่แตกต่างกัน โดยแต่ละไอออนมีความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ใน C ด้านบน แสดง Coomassie ย้อม nsp9-His6 และใน C ด้านล่าง แสดงภาพอัตโนมัติที่สอดคล้องกันขนาดของโปรตีนที่มีฉลาก (เป็นกิโลดาลตัน) จะแสดงทางด้านซ้ายของ A และ C (D) รูปแบบกลายพันธุ์ของ HCoV-229E nsp12-His6 ซึ่งมีการทดแทนกรดอะมิโนที่ระบุอยู่ใน [α-32P]UTP ตามที่อธิบายไว้ ในวัสดุและวิธีการradiolabeled nsp9-His6 ที่ผลิตในปฏิกิริยา NMPylation ถูกตรวจพบโดยการถ่ายภาพฟอสโฟรีเลชั่น (D, ด้านบน)กิจกรรมสัมพัทธ์เมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนชนิด wild (wt) จะแสดงใน D และด้านล่างนำมาเป็นค่าเฉลี่ย (±SEM) จากการทดลองอิสระสามครั้งเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงการทดแทนสารตกค้างที่ไม่อนุรักษ์( E ) ตัวไตเตรทของไวรัสในส่วนเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงของเซลล์ p1 ที่ได้รับ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อถูกกำหนดโดยการตรวจคราบจุลินทรีย์การแทนที่โคดอนในโดเมน NiRAN ของพันธุ์กลาย HCoV-229E ที่ถูกทำวิศวกรรมถูกระบุ (การกำหนดหมายเลขเรซิดิวขึ้นอยู่กับตำแหน่งของพวกมันใน pp1ab)การจำลองไซต์กลายพันธุ์ที่บกพร่องของ RdRp กลายพันธุ์ nsp12_DD4823/4AA ถูกใช้เป็นตัวควบคุม
เพื่อให้เข้าใจอย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับตำแหน่งแอคทีฟของ NiRAN และกำหนดสิ่งตกค้างที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมของการถ่ายโอน NMP เฉพาะของ nsp9 เราได้ทำการวิเคราะห์การกลายพันธุ์ ซึ่งเราแทนที่สิ่งตกค้างแบบอนุรักษ์ในลวดลาย NiRAN AN, BN และ CN ( 16) มันคือ Ala (ภาคผนวก SI, รูปที่ S2)นอกจากนี้ ผลกระทบของการทดแทน Arg-to-Lys หรือ Lys-to-Arg แบบอนุรักษ์นิยมได้รับการประเมินในสองกรณีในฐานะกลุ่มควบคุม (เชิงลบ) สารตกค้างที่ไม่ได้รับการอนุรักษ์หรืออนุรักษ์ไว้ในโดเมน NiRAN ของโคโรนาไวรัสและไวรัสที่ซ้อนกันอื่นๆ จะถูกแทนที่ด้วย Ala การแทนที่ K4116A (ในบรรทัดฐาน preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (บรรทัดฐาน) BN) และ D4280A (CN) ช่วยลดหรือกำจัด nsp9 NMPylation อย่างมีนัยสำคัญผ่าน nsp12 ในขณะที่โปรตีนที่มีการทดแทนแบบอนุรักษ์ (R4178K) , K4116R) ยังคงรักษากิจกรรมไว้ 60% และ 80% ซึ่งบ่งชี้ว่าการผ่อนคลายข้อจำกัดในด้านที่เกี่ยวข้อง โซ่มีความไวต่อเคมีกายภาพ (รูปที่ 3 มิติ)การแทนที่สารตกค้างอนุรักษ์อื่นๆ E4145A, D4273A, F4281A และ D4283A มีอันตรายน้อยกว่ามากและ UMPylation nsp9 จะลดลงปานกลางเท่านั้นผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้รับในปฏิกิริยา nsp9 NMPylation ที่เกี่ยวข้องกับ NTP อื่น ๆ (รูปที่ 3D และภาคผนวก SI, รูปที่ S3) ซึ่งยืนยันว่าผลที่สังเกตได้ต่อการทดแทนกรดอะมิโนที่เฉพาะเจาะจงนั้นไม่ขึ้นอยู่กับประเภทของพื้นผิวร่วมนิวคลีโอไทด์ที่ใช้ต่อไป เราได้ทดสอบผลกระทบที่เป็นไปได้ของการทดแทน nsp12 เหล่านี้ต่อการจำลองแบบของโคโรนาไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ด้วยเหตุนี้ เราจึงใช้เทมเพลต DNA เสริมที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมที่เหมาะสม (cDNA) ซึ่งโคลนในไวรัสวัคซีนรีคอมบิแนนท์ (23, 24) เพื่อถอดเสียงเซลล์ 5 -7 เซลล์การไตเตรทของลูกหลานของไวรัสติดเชื้อที่ผลิตในเซลล์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของ NiRAN HCoV-229E ส่วนใหญ่ไม่สามารถทำได้ (รูปที่ 3E)กลุ่มของไวรัสกลายพันธุ์ที่ไม่สามารถทำงานได้รวมถึงทางเลือกอื่นที่ได้รับการแสดงให้เห็นว่าสามารถกำจัดหรือลดการทำงานของ NMP Transferase ในหลอดทดลองได้อย่างมีนัยสำคัญ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) แต่ยังมีทางเลือกอื่นอีกสองทาง (K4116R, E4145A) 80 % ที่สงวนไว้?กิจกรรม NMPylation ในหลอดทดลอง แสดงให้เห็นว่ามีข้อ จำกัด เพิ่มเติมที่เกี่ยวข้องในทำนองเดียวกัน การกลายพันธุ์อีกสองรายการ (R4178K, F4281A) ที่ทำให้กิจกรรม NMPylation ในหลอดทดลอง ของ NiRAN ลดลงปานกลางทำให้เกิดไวรัสที่มีชีวิต อย่างไรก็ตาม ไวรัสเหล่านี้ลดระดับ titers ลงอย่างมากผ่านการจำลองแบบสอดคล้องกับข้อมูลกิจกรรมในหลอดทดลองที่แสดงในรูปที่ 3D โดยแทนที่สารตกค้างอื่นๆ อีก 4 ชนิดที่ไม่อนุรักษ์ไว้ในไวรัสโคโรนาและ/หรือไวรัสอื่นๆ ที่ซ้อนกัน (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ทำให้เกิดไวรัสที่ทำงานได้ ลูกหลานแม้ว่าจะมี titer ที่ลดลงปานกลางเมื่อเปรียบเทียบกับไวรัสชนิดไวด์ (รูปที่ 3E)
เพื่อศึกษาว่ากิจกรรมการถ่ายโอน NMP ที่ใช้สื่อกลางของ NiRAN นั้นขึ้นอยู่กับโดเมน RdRp ที่ใช้งานอยู่หรือไม่นั้น Asp ที่อนุรักษ์ไว้สองตัวที่เกี่ยวข้องกับการประสานงานของไอออนโลหะไดวาเลนต์ (11) ใน RdRp motif C ถูกแทนที่ด้วย Ala โปรตีนที่ได้ nsp12_DD4823/4AA ยังคงอยู่ กิจกรรม nsp9 NMPylation ของมัน ซึ่งบ่งชี้ว่ากิจกรรม nsp12-mediated ในหลอดทดลอง nsp9 NMPylation ไม่ต้องการกิจกรรมโพลีเมอเรส (SI ภาคผนวก, รูปที่ S4)
หลังจากสร้างกิจกรรมการถ่ายโอน NMP เฉพาะของ nsp9 สำหรับ nsp12 เราพยายามอธิบายลักษณะ adduct ของ NMP-nsp9 โดยแมสสเปกโตรมิเตอร์ (MS)สเปกตรัมมวลโปรตีนที่สมบูรณ์ของรีคอมบิแนนท์ HCoV-229E nsp9 แสดงจุดสูงสุดที่ 12,045 Da (รูปที่ 4A)การเพิ่ม nsp12 ไม่ได้เปลี่ยนคุณภาพของ nsp9 ซึ่งบ่งชี้ว่า nsp12 และ nsp9 จะไม่ก่อให้เกิดคอมเพล็กซ์ที่เสถียรภายใต้เงื่อนไขที่ใช้ (การสูญเสียสภาพธรรมชาติ) (รูปที่ 4A)เมื่อมี UTP และ GTP การตรวจวัดมวลของปฏิกิริยาที่มี nsp9 และ nsp12 ตามลำดับแสดงให้เห็นว่ามวลโปรตีนของ UTP เคลื่อนที่ 306 Da และมวลโปรตีนของ GTP เคลื่อนที่ 345 Da ซึ่งบ่งชี้ว่าโมเลกุล nsp9 แต่ละโมเลกุลจับ UMP หรือ GMP (ภาพที่ 4) C และ D)มีการคาดเดาว่าพลังงานที่จำเป็นสำหรับ nsp9 NMPylation ที่เป็นสื่อกลางของ NiRAN นั้นมาจากการไฮโดรไลซิสของ NTP และการปล่อยไพโรฟอสเฟตแม้ว่าจะใช้ฟันกรามส่วนเกิน 10 เท่าของ nsp9 (เป้าหมาย) มากกว่า nsp12 (เอนไซม์) ในปฏิกิริยานี้ แต่พบว่า NMPylation ของ nsp9 เกือบจะสมบูรณ์ ซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่าง nsp12 และ nsp9 นั้นมีอายุสั้น และ nsp12 สามารถ NMPylate ได้มากกว่า nsp9 โมเลกุลในหลอดทดลอง
NMPylation เดี่ยวของ nsp9 ต่อหน้า nsp12 และ UTP หรือ GTPแสดงให้เห็นว่าเป็นสเปกตรัมมวลโปรตีนสมบูรณ์ที่แยกส่วนแล้วของ HCoV-229E nsp9 (ภาคผนวก SI, ตาราง S1) (AD)(A) nsp9 เพียงอย่างเดียว (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 ต่อหน้า UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ต่อหน้า GTP
ในการตรวจสอบสิ่งตกค้าง nsp9 UMPylated โดย nsp12 นั้น nsp9-UMP จะถูกแยกด้วยทริปซินเปปไทด์ที่ได้จะถูกแยกโดยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงระดับนาโน (HPLC) และวิเคราะห์โดยแมสสเปกโตรเมทรีแบบเรียงกัน (MS/MS) ทางออนไลน์การวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ Byonic (ตัวชี้วัดโปรตีน) แสดงการสร้าง UMPylation ของกรดอะมิโนที่ปลาย Nสิ่งนี้ได้รับการยืนยันด้วยตนเองสเปกตรัมมวลตามกันของสารตั้งต้นเปปไทด์ [UMP]NNEIMPGK (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5A) เผยชิ้นส่วนที่ 421 m/z ซึ่งบ่งชี้ว่า UMP จับกับเรซิดิว 1 ของ nsp9
ที่ N-terminus ของ nsp9 Asn จะถูกอนุรักษ์ไว้ในหมู่สมาชิกของ Orthocoronavirinae (ภาคผนวก SI, รูปที่ S6)แม้ว่าเราจะเชื่อว่าไนโตรเจนเอมีนปฐมภูมิของ N-terminal เป็นตัวรับที่น่าจะเป็นไปได้มากที่สุดสำหรับ UMP แต่เราตัดสินใจที่จะรับหลักฐานเพิ่มเติมของการเชื่อมโยง NMP ที่ N-terminalด้วยเหตุนี้ เปปไทด์ที่ปลาย N ที่ไม่ใช่ NMPylated และ NMPylated nsp9 ที่ทำให้บริสุทธิ์โดย HPLC จึงได้มาจากอะซิโตนและโซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์ที่มีอยู่ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เฉพาะเอมีนหลักอิสระเท่านั้นที่สามารถแก้ไขได้ด้วยโพรพิล (25)เปปไทด์ที่ได้มาจาก N-terminal nsp9 ที่มีลำดับ NNEIMPGK ประกอบด้วยเอมีนหลักสองตัว ตัวแรกที่ปลาย N ของ Asn และอีกอันอยู่ที่สายโซ่ด้านข้างของ Lys ที่ปลาย Cดังนั้นจึงสามารถใช้กลุ่มโพรพิลได้ที่ปลายทั้งสองข้างไอออนโครมาโตกราฟีที่สกัดได้ของเปปไทด์ที่ไม่ใช่ NMPylated จะแสดงในภาคผนวก SI รูปที่ S5Bตามที่คาดไว้ สามารถระบุเปปไทด์ที่ปลาย N และปลาย C (โมโน) ที่ถูกโพรพิเลต (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5B, เลนบน) และเปปไทด์แบบไดโพรพิลเลต (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5B, เลนล่าง)รูปแบบนี้เปลี่ยนไปเมื่อใช้เปปไทด์ NMPylated N-terminal ของ nsp9ในกรณีนี้ สามารถระบุได้เฉพาะเปปไทด์โพรพิลเลตที่ปลาย C เท่านั้น แต่ไม่ได้ระบุเปปไทด์โพรพิลเลตที่ปลาย N และเปปไทด์แบบไดโพรพิลเลตไม่ได้ระบุ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5C) ซึ่งบ่งชี้ว่า UMP ถูกถ่ายโอนไปยังเอมีนปฐมภูมิที่ปลาย N เพื่อป้องกันสิ่งนี้ กลุ่มจากการเปลี่ยนแปลง
ต่อไป เราจะแทนที่ (ด้วย Ala หรือ Ser) หรือลบสิ่งตกค้างที่อนุรักษ์ไว้ที่ N-terminus ของ nsp9 เพื่อกำหนดข้อจำกัดเฉพาะเป้าหมายจากข้อมูล MS ของเราแสดงให้เห็นว่า NiRAN สร้าง adduct nsp9-NMP ด้วยเอมีนปฐมภูมิของ N-terminal ที่ตกค้างของ nsp9 เราตั้งสมมติฐานว่า nsp9 NMPylation ต้องใช้โปรตีเอสต้นแบบของไวรัส (Mpro, nsp5) เพื่อปล่อย nsp9 N-terminal จาก สารตั้งต้นของโพลีโปรตีนเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราได้ผลิตสารตั้งต้นโปรตีน nsp7-11 ที่มี nsp9 ใน E. coli และทำการทดสอบ NMPylation มาตรฐานเมื่อมี [α-32P] UTP (วัสดุและวิธีการ)ดังที่แสดงในรูปที่ 5A (เลน 3) สารตั้งต้น nsp7-11 ที่ยังไม่ได้เจียระไนจะไม่ติดป้ายกำกับรังสีด้วย nsp12ในทางตรงกันข้าม หาก nsp7-11 ถูกแยกออกโดย recombinant nsp5 เพื่อปล่อย nsp9 (และ nsps อื่น ๆ ) จากสารตั้งต้น จะตรวจพบโปรตีนที่มีป้ายกำกับรังสีซึ่งย้ายด้วย nsp9 ซึ่งเป็นการยืนยันข้อสรุปของเราว่า NiRAN และ N- การก่อตัวของ adducts แบบเลือกสรรของโควาเลนต์ nsp9-NMP .เอมีนปฐมภูมิที่ปลายของ Asn ที่ปลาย N (ตำแหน่ง 3825 ใน pp1a/pp1ab)ข้อสรุปนี้ยังได้รับการสนับสนุนจากการทดลองโดยใช้โครงสร้าง nsp9 ซึ่งมีสารตกค้างเพิ่มเติมหนึ่งหรือสองตัวที่ปลาย Nในทั้งสองกรณี UMPylation ที่เป็นสื่อกลางของ NiRAN ของ nsp9 ถูกยกเลิก (ภาคผนวก SI, รูปที่ S7)ต่อไปเราผลิตโปรตีนที่มี Asn ตกค้างหนึ่งหรือสองตัวที่ถูกลบออกจากลำดับเปปไทด์ 3825-NNEIMPK-3832 ที่ N-terminal ของ nsp9ในทั้งสองกรณี nsp9 UMPylation ถูกบล็อกอย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 5B) ซึ่งให้หลักฐานเพิ่มเติมว่าปลายทาง Nsp9 จริงทำหน้าที่เป็นตัวรับ NMP
การประมวลผลโปรตีโอไลติกของ nsp9 และบทบาทของ N-terminal ที่ตกค้างใน UMPylation ที่ใช้สื่อกลาง nsp12(A) nsp9 UMPylation ต้องการเทอร์มินัล Nsp9 ฟรีNsp7-11-His6 ได้รับการบ่มล่วงหน้าที่ 30 °C ในบัฟเฟอร์การตรวจจับ NMPylation ที่มี UTP เมื่อมีหรือไม่มี Mpro ชนิดรีคอมบิแนนท์ (nsp5-His6)หลังจากผ่านไป 3 ชั่วโมง ให้เริ่มการทดสอบ NMPylation โดยการเพิ่ม nsp12-His6 ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการปฏิกิริยาที่มี nsp5-His6 (เลน 1) และ nsp9-His6 (เลน 2) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมหลังจากผ่านไป 10 นาที ปฏิกิริยายุติลงและของผสมปฏิกิริยาถูกแยกโดย SDS-PAGEโปรตีนถูกย้อมด้วย Coomassie Brilliant Blue (A, บนสุด)สารตั้งต้น Nsp7-11-His6 และผลิตภัณฑ์แปรรูปที่เป็นผลจากการตัดแยกที่มีสื่อกลาง nsp5-His6 แสดงอยู่ทางด้านขวาโปรดทราบว่า (เนื่องจากมีขนาดเล็ก) เจลนี้จึงตรวจไม่พบ nsp7 และ nsp11-His6 และปฏิกิริยาจะเสริมด้วย nsp5-His6 (เลน 1 และ 4 ตำแหน่งของ nsp5-His6 ระบุด้วยวงกลมทึบ) หรือ nsp9-His6 (เลน 2) มี MBP จำนวนเล็กน้อย (ระบุโดยวงกลมเปิด) เป็นสิ่งเจือปนที่ตกค้างเนื่องจากแสดงเป็นโปรตีนฟิวชั่น MBP (ภาคผนวก SI, ตาราง S1)(B) ตัวแปร Nsp9-His6 ขาดสารตกค้าง Asn ที่ปลาย N หนึ่งหรือสองตัว (หมายเลขสารตกค้างตามตำแหน่งใน pp1a/pp1ab) และถูกทำให้บริสุทธิ์และบ่มด้วย nsp12-His6 และ [α-32P] UTPB, SDS-PAGE ที่ย้อมด้วย Coomassie จะแสดงที่ด้านบน, B, เครื่องบันทึกภาพอัตโนมัติที่สอดคล้องกันจะแสดงที่ด้านล่างตำแหน่งของเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล (เป็นกิโลดาลตัน) จะแสดงทางด้านซ้าย( C ) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal ตกค้างถูกแทนที่ด้วย Ala หรือ Ser และใช้โปรตีนในปริมาณเท่ากันในปฏิกิริยา UMPylation ที่เป็นสื่อกลางของ nsp12-His6ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาถูกแยกโดย SDS-PAGE และย้อมด้วย Coomassie Brilliant Blue (C, ด้านบน) และตรวจพบ radiolabeled nsp9-His6 โดยการถ่ายภาพเรืองแสง (C, กลาง)การใช้โปรตีนชนิด wild (wt) เป็นข้อมูลอ้างอิง (ตั้งค่าเป็น 100%) กิจกรรม NMPylation สัมพัทธ์ (ค่าเฉลี่ย ± SEM) คำนวณจากการทดลองอิสระสามครั้ง( D ) ตัวไตเตรทของไวรัสในส่วนเหนือของการเพาะเลี้ยงเซลล์ p1 ของเซลล์ Huh-7 ที่ติดเชื้อเซลล์ Huh-7 ชนิดไวด์ HCoV-229E และการกลายพันธุ์ที่มีการทดแทนกรดอะมิโนที่กำหนดใน nsp9 ถูกกำหนดโดยการทดสอบคราบจุลินทรีย์แม่ลาย RdRp ที่ขาดการจำลองแบบ C พันธุ์กลายคู่ DD4823/4AA ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ
ปลายทาง N ของ nsp9 (โดยเฉพาะตำแหน่ง 1, 2, 3 และ 6) ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างมากในหมู่สมาชิกของวงศ์ย่อย Orthocoronavirinae (ภาคผนวก SI, รูปที่ S6)เพื่อศึกษาบทบาทที่เป็นไปได้ของสารตกค้างเหล่านี้ใน nsp12-mediated nsp9 NMPylation สารตกค้าง Asn สองตัวติดต่อกันที่ N-terminus ของ nsp9 จะถูกแทนที่ด้วย Ala หรือ Ser (เพียงอย่างเดียวหรือรวมกัน)เมื่อเปรียบเทียบกับ nsp9 แบบ wild การแทนที่ N3825 ด้วย Ala หรือ Ser ส่งผลให้ UMPylation ที่ใช้สื่อกลาง nsp12 ลดลงมากกว่าสองเท่า (รูปที่ 5C)สอดคล้องกับข้อสรุปของเราว่า NMPylation เกิดขึ้นที่เอมีนปฐมภูมิของ N-terminal แทนที่จะเป็นโซ่ด้านข้างของสารตกค้างของ N-terminal เราสังเกตเห็น NMPylation ที่ตกค้างอย่างมีนัยสำคัญด้วยการแทนที่ N3825A และ N3825Sที่น่าสนใจคือ ถ้า Asn ที่สองถูกแทนที่ด้วย Ala หรือ Ser nsp9 UMPylation จะลดลงอย่างมาก (มากกว่า 10 ครั้ง) ในขณะที่การแทนที่ Ala ที่ตำแหน่ง 3, 4 และ 6 มีผลปานกลางต่อ nsp9 UMPylation เท่านั้น (รูปที่ 2 ) .5ซี)ผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้รับโดยใช้ ATP, CTP หรือ GTP (ภาคผนวก SI, รูปที่ S8)โดยรวมแล้วข้อมูลเหล่านี้บ่งบอกถึงบทบาทสำคัญของ N2826 (ตำแหน่ง 2 ใน nsp9) ใน nsp9 NMPylation
เพื่อให้ได้หลักฐานเพิ่มเติมเกี่ยวกับความสัมพันธ์ในการทำงานระหว่าง N-terminus ของ nsp9 และ NMPylation เราได้ดำเนินการจัดตำแหน่งหลายลำดับ (MSA) ของลำดับ nsp9 ของตระกูล Corona Virus (แตกต่างกันระหว่าง 104 และ 113 สารตกค้าง) (SI ภาคผนวก รูปที่ S6 ).โดยรวมแล้ว ในวงศ์ย่อย Orthocoronavirinae จำนวน 5 สกุล (ที่รู้จักและสมมุติฐาน) จำนวน 47 สปีชีส์ที่แพร่ระบาดในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม นก และโฮสต์ของสัตว์เลื้อยคลานต่างๆ พบเพียง 8 ชนิดที่ตกค้างเท่านั้นที่ไม่แปรเปลี่ยนการเปลี่ยนแปลงที่ครอบคลุมที่สุด รวมถึงการลบและการแทรก ถูกพบในวงจรระหว่างองค์ประกอบโครงสร้างทุติยภูมิของ nsp9 ตามที่กำหนดโดยการศึกษาโครงสร้างก่อนหน้านี้ (26 × 28)พบสารตกค้างที่ไม่แปรเปลี่ยนห้าตัวใน β strand และ α helix ของส่วน C-terminal ของ nsp9สารตกค้างที่ไม่แปรเปลี่ยนสามตัวประกอบเป็นมาตรฐาน NNE ของปลายทาง N ของ nsp9มีการเปิดเผยว่า Asn ที่สองของมาตรฐานนี้เป็นสารตกค้างที่ไม่แปรเปลี่ยนเพียงชนิดเดียว ซึ่งมีการแบ่งปันโดย nsp9 สมมุติของโคโรนาไวรัสกบที่เกี่ยวข้องระยะไกล และเป็นตัวแทนของ Microhyla Letovirus 1 สปีชีส์ในวงศ์ย่อย Letovirinae ของ Alphaletovirusการอนุรักษ์สิ่งตกค้างในองค์ประกอบโครงสร้างทุติยภูมิ nsp9 สามารถหาเหตุผลเข้าข้างตนเองได้โดยการพิจารณาด้านโครงสร้างเพื่อรักษาคุณสมบัติการพับหรือการจับ RNA ที่ทราบอย่างไรก็ตาม เหตุผลนี้ดูเหมือนจะใช้ไม่ได้กับการอนุรักษ์ NNE และก่อนการศึกษานี้ ลักษณะของข้อจำกัดที่จำกัดการเปลี่ยนแปลงของลำดับไตรเปปไทด์นั้นถูกบดบังโดยสิ้นเชิง
เพื่อกำหนดความสำคัญของ nsp9-NMPylation และการอนุรักษ์ NNE ในการจำลองแบบโคโรนาไวรัส เราได้ผลิตการกลายพันธุ์ของ HCoV-229E ซึ่งมีการทดแทน nsp9 N-terminal ที่ตกค้างเพียงครั้งเดียวหรือสองครั้ง ซึ่งบ่งชี้ว่า nsp9 NMPylation เป็นอันตราย ในหลอดทดลองก่อนที่เราจะเริ่ม เราพยายามตอบคำถามว่าการทดแทนเหล่านี้ (ใกล้กับจุดแตกแยก nsp8 | 9) ส่งผลต่อการประมวลผลโปรตีโอไลติกของภูมิภาค C-terminal pp1a หรือไม่ชุดของโครงสร้างโพลีโปรตีน nsp7-11 ที่มีการทดแทนที่สอดคล้องกันที่ปลาย N ของ nsp9 ถูกผลิตขึ้นใน E. coli และตัดด้วย recombinant Mproความแตกแยกของโปรตีโอไลติกของสี่ไซต์ (รวมถึงไซต์ขนาบข้าง nsp9) ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากการทดแทนที่แนะนำ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S9) ไม่รวมการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในโปรตีนเหล่านี้ที่รบกวนความแตกแยกของ Mpro-mediated nsp8 | 9 ( หรืออื่น ๆ ) เว็บไซต์.
เซลล์ Huh-7 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วย HCoV-229E RNA ที่มีความยาวจีโนม เข้ารหัสการทดแทน Ala หรือ Ser ใน NNE tripeptides ที่ได้รับการอนุรักษ์ (N3825, N3826 และ E3827) ที่ปลายทาง nsp9 N แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ส่วนใหญ่เป็นอันตรายถึงชีวิตเราสามารถช่วยเหลือไวรัสได้โดยการแทนที่ Ser หรือ Ala ของ N-terminal Asn (N2835A หรือ N2835S) แต่ล้มเหลวในการกู้คืนไวรัสด้วยการกลายพันธุ์แบบเดี่ยวและคู่อื่นๆ ในลำดับ NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (รูปที่ 5D)
ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการจำลองแบบของไวรัสโคโรนาในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อนั้นถูกจำกัด (เหมือนหรือคล้ายกัน) จำกัดการกลายพันธุ์ตามธรรมชาติของตำแหน่ง NSP9 NMPylation ในร่างกาย และสนับสนุนบทบาทสำคัญของการตอบสนองนี้ในวงจรชีวิตของไวรัสโคโรนา
ในการทดลองชุดสุดท้าย เราได้สร้าง C-terminal His6 ที่มีป้ายกำกับว่า SARS-CoV-2 nsp12 และ nsp9 และรูปแบบกลายพันธุ์ของ nsp12 สองรูปแบบใน E. coliสารตกค้างของไซต์ที่ใช้งานอยู่ในโดเมน NiRAN และ RdRp ตามลำดับใช้ Ala แทน (รูปที่ 6A และภาคผนวก SI, ตาราง S2)K4465 ใน SARS-CoV-2 nsp12 สอดคล้องกับ K4135 ใน HCoV-229E (ภาคผนวก SI, รูปที่ S2) ซึ่งพิสูจน์แล้วว่าจำเป็นสำหรับกิจกรรม NiRAN และการจำลองแบบ HCoV-229E (รูปที่ 3D และ E)สารตกค้างนี้ยังสอดคล้องกับไวรัสหลอดเลือดแดง EAV nsp9 K94 ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่ามีความจำเป็นสำหรับ NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16)ดังที่แสดงในรูปที่ 6B SARS-CoV-2 nsp12 มีกิจกรรมการถ่ายโอน UMP โดยใช้ nsp9 เป็นสารตั้งต้น ในขณะที่การกลายพันธุ์ของไซต์ที่ใช้งาน nsp12_K4465A ไม่ได้ใช้งานการทดแทนสองครั้งในลำดับลักษณะ SDD ของมาตรฐาน RdRp C ไม่ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมการถ่ายโอน UMP (รูปที่ 6B) ซึ่งบ่งชี้ว่ากิจกรรม RdRp ไม่มีผลโดยตรงใน nsp9 UMPylationได้รับข้อมูลที่คล้ายกันโดยใช้ CTP, GTP และ ATP (ภาคผนวก SI, รูปที่ S10)โดยสรุป ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า nsp9 NMPylation ที่เป็นสื่อกลางของ NiRAN มีกิจกรรมอนุรักษ์ในโคโรนาไวรัสซึ่งเป็นตัวแทนของสกุลย่อยของ orthocoronavirus
NMPylation ที่ใช้สื่อกลาง SARS-CoV-2 nsp12 ของ nsp9( A ) เจล SDS-polyacrylamide ย้อมสี Coomassie แสดงโปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่ใช้ในการทดสอบ NMPylationในส่วนควบคุม มีการใช้โปรตีนกลายพันธุ์ที่มีการทดแทนตำแหน่งออกฤทธิ์ในโดเมน NiRAN (K4465A) และโดเมน RdRp (DD5152/3AA) ของ SARS-CoV-2 nsp12การกำหนดหมายเลขสารตกค้างขึ้นอยู่กับตำแหน่งใน pp1ab( B ) Autoradiograph ของการตรวจจับ UMPylation โดยใช้ nsp9-His6 และ [α-32P] UTP เป็นสารตั้งต้นของ nsp12-His6 (ประเภทไวด์ [wt] และกลายพันธุ์)มวลโมเลกุล (เป็นกิโลดาลตัน) ของโปรตีนที่มีป้ายกำกับจะแสดงทางด้านซ้าย
โดยทั่วไปโดเมน NiRAN จะได้รับการอนุรักษ์ใน Nidovirales (16) ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันกระตุ้นปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่จำเป็นสำหรับการจำลองแบบ Nidovirusในการศึกษานี้ เราสามารถพิสูจน์ได้ว่าโดเมน NiRAN ของไวรัสโคโรนาถ่ายโอน NMP (สร้างจาก NTP) ไปยัง nsp9 ซึ่งเป็นโปรตีนที่จับกับ RNA ลึกลับที่เกี่ยวข้องกับการจำลองแบบของไวรัส (26 ?? 29 ) เพื่อพิจารณาว่าเป็นเป้าหมายตามธรรมชาติและ พันธมิตรของไวรัสโคโรนา RTC
โดเมน NiRAN ใช้แม่ลายลำดับสามแบบร่วมกัน (AN, BN และ CN) ซึ่งมีสารตกค้างจำนวนน้อยมากที่ได้รับการอนุรักษ์ในทุกตระกูลในลำดับ Nidovirales แบบ monophyletic แต่มีความแตกต่างอย่างมาก (8, 16)การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าพวกมันมีความสัมพันธ์เชิงโครงสร้างกับตระกูลโปรตีนคล้ายไคเนสที่ไม่เคยมีมาก่อนซึ่งเดิมเรียกว่าตระกูล SelO (17, 19, 22, 30, 31)โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ SelO มีไคเนสเท่า แต่ขาดสารตกค้างจากไซต์ออกฤทธิ์ที่ได้รับการอนุรักษ์หลายชนิดในไคเนสคลาสสิก (22, 32)จากการวางแนวย้อนกลับของโมเลกุล ATP ที่ถูกจับกับบริเวณที่มีฤทธิ์และเสถียรโดยปฏิกิริยาเฉพาะ SelO ได้รับการตั้งสมมติฐานและได้รับการยืนยันในเวลาต่อมาว่าถ่ายโอน AMP (แทนฟอสเฟต) ไปยังสารตั้งต้นโปรตีน (22) ในขณะที่โปรตีนคล้าย SelO ของแบคทีเรียอีกตัวหนึ่ง YdiU มี เมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าสามารถกระตุ้นการเกาะติดโควาเลนต์ของ UMP กับ Tyr และสารตกค้างของสารตั้งต้นโปรตีนต่างๆ (33)
เพื่อยืนยันและขยายการทำนายสิ่งตกค้างจากไซต์สมมุติของโดเมน NiRAN ของไวรัสโคโรนา เราใช้วิธีการทางชีวเคมีและพันธุศาสตร์ย้อนกลับเพื่อทำการวิเคราะห์การกลายพันธุ์บนไวรัสโคโรนา nsp12 (รูปที่ 3D และภาคผนวก E และ SI, รูปที่ S3 และตาราง) S1â S4)ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าการแทนที่ HCoV-229E K4135, R4178 และ D4280 ด้วย Ala ช่วยลดกิจกรรมการถ่ายโอน NMP ในหลอดทดลอง และการจำลองแบบของไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ (รูปที่ 3 มิติและภาคผนวก E และ SI, รูปที่ S3) สนับสนุนการมีอยู่ของพวกมันใน NTP γ-ฟอสเฟต ( K4135, R4178) และการประสานงานของไอออนของโลหะบริเวณที่ทำงาน (D4280)การทดแทน E4145A ของ Glu อนุรักษ์ในช่วงของไวรัสรังนกที่คาดการณ์ว่าจะทำให้ตำแหน่ง K4135 (17) คงที่นั้นแสดงให้เห็นว่าสามารถกำจัดการจำลองแบบของไวรัสได้ แต่น่าแปลกใจที่กิจกรรมดังกล่าวยังคงอยู่ในการทดสอบ NMPylation ในหลอดทดลอง (รูปที่ 3D และ E และ ภาคผนวก SI รูปที่ S3 และตาราง S1–S4)การสังเกตที่คล้ายกันนี้เกิดขึ้นเมื่อมีการใช้การทดแทนที่สอดคล้องกันใน YdiU homolog ของเชื้อ Salmonella typhimurium (E130A) (33)เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนการทำงานด้านกฎระเบียบของสารตกค้างที่ได้รับการอนุรักษ์นี้ มากกว่าฟังก์ชันการเร่งปฏิกิริยา
การแทนที่เพที่อนุรักษ์ไว้ (F4281A) ภายในช่วงของเนสโตไวรัสในโดเมน HCoV-229E NiRAN (8) ส่งผลให้กิจกรรม NMPylation ในหลอดทดลอง ลดลง และลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการจำลองไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ (รูปที่ 3 มิติ, E และ SI) ภาคผนวก รูปที่ S3)ข้อมูลสอดคล้องกับหน้าที่ด้านกฎระเบียบที่สำคัญของสารตกค้างนี้ เช่น เรซิดิวเพของมาตรฐาน DFG ที่คล้ายคลึงกันที่แสดงก่อนหน้านี้ในไคเนสโปรตีนคลาสสิก มันเป็นส่วนหนึ่งของห่วงจับ Mg2+ และช่วยในการประกอบและควบคุมกระดูกสันหลัง??จำเป็นสำหรับกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพ (32, 34)การแทนที่ Ala และ Arg สำหรับสารตกค้าง K4116 (ในบรรทัดฐาน preAN) ตามลำดับ จะกำจัดการจำลองแบบของไวรัส และตามที่คาดไว้ มีผลกระทบที่แตกต่างกันต่อกิจกรรมการถ่ายโอน NMP ในหลอดทดลอง ขึ้นอยู่กับโซ่ข้างกรดอะมิโนที่แนะนำ (รูปที่ 3 มิติ และภาคผนวก E และ SI , รูปที่ S3)ข้อมูลการทำงานสอดคล้องกับข้อมูลโครงสร้าง ซึ่งบ่งชี้ว่าสารตกค้างนี้ได้สร้างปฏิกิริยากับ ATP ฟอสเฟต (17)ในโดเมน NiRAN ของตระกูลไวรัสที่ซ้อนกันอื่นๆ ตำแหน่งของ HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ถูกครอบครองโดย Lys, Arg หรือ His (8) ซึ่งบ่งชี้ว่าข้อจำกัดการทำงานของสารตกค้างเฉพาะนี้ได้ผ่อนคลายลงการแทนที่ D4188A และ D4283A จะกำจัดหรือลดการทำงานของเอนไซม์อย่างรุนแรง และกำจัดการจำลองแบบของไวรัส (รูปที่ 3)สารตกค้างทั้งสองนี้ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในไวรัสที่ซ้อนกันส่วนใหญ่ (แต่ไม่ใช่ทั้งหมด) (8) ซึ่งบ่งบอกถึงการทำงานที่สำคัญเฉพาะตระกูล แต่อาจไม่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการทดแทน Ala ของ Lys และ Asp ตกค้างอื่น ๆ (K4113A, D4180A, D4197A และ D4273A) ที่ไม่ได้รับการอนุรักษ์ใน Coronaviridae หรือตระกูล Nestioviridae อื่น ๆ (8) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมตามที่คาดไว้ การทดแทนเหล่านี้ส่วนใหญ่สามารถยอมรับได้ โดยมีกิจกรรมของเอนไซม์และการจำลองแบบของไวรัสลดลงเล็กน้อยในบางกรณี (รูปที่ 3 และภาคผนวก SI, รูปที่ S3)โดยรวมแล้ว ข้อมูลการกลายพันธุ์ของไวรัสโคโรนามีความสอดคล้องกับ GMP ด้วยตนเองและข้อมูลพันธุกรรมแบบย้อนกลับของ EAV NiRAN-RdRp (16) ซึ่ง EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) ตกค้าง K94 (ตรงกับ HCoV- 229E K4135) ทำหน้าที่สำคัญ) R124 (ตรงกับ R4178), D132 (ตรงกับ D4188), D165 (ตรงกับ D4280), F166 (ตรงกับ F4281)นอกจากนี้ ข้อมูลการกลายพันธุ์ของ HCoV-229E ยังสอดคล้องและขยายจากข้อมูลพันธุกรรมแบบย้อนกลับของ SARS-CoV ที่รายงานไปก่อนหน้านี้ (16) เช่นเดียวกับข้อมูลที่คล้ายกันมากกับข้อมูลที่สังเกตได้จากมาตรฐาน CN ที่สอดคล้องกัน Phe-to-Ala กลายพันธุ์ SARS-CoV_nsp12 ฟีโนไทป์ที่อธิบายไว้ -F219A และ HCoV-229E_F4281A (รูปที่ 3 D และ E และภาคผนวก SI, รูปที่ S3 และตาราง S1-S4)
เมื่อเปรียบเทียบกับ EAV orthologs (16) ซึ่งมีความพึงพอใจที่ชัดเจนสำหรับ UTP และ GTP (ในปฏิกิริยา NMPylation ด้วยตนเอง) การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าโดเมน coronavirus NiRAN (แสดงโดย HCoV-229E และ SARS-CoV-2) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ถ่ายโอน NMP ทั้งสี่แม้ว่าจะมีการตั้งค่า UMP เล็กน้อย (รูปที่ 1 และ 3)ความจำเพาะที่ค่อนข้างต่ำของพื้นผิวร่วม NTP ที่เฉพาะเจาะจงนั้นสอดคล้องกับโครงสร้างซูเปอร์คอมโพสิต SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ที่รายงานเมื่อเร็วๆ นี้ ซึ่ง ADP-Mg2+ ผูกกับตำแหน่งที่ใช้งานของ NiRAN แต่ไม่มีส่วนอะดีนีน ของการก่อตัวของปฏิสัมพันธ์เฉพาะ (17)ในการศึกษาของเรา ประเภทของนิวคลีโอไทด์ที่ใช้ในปฏิกิริยา NMPylation ไม่มีผลกระทบต่อกิจกรรมของโปรตีนกลายพันธุ์ (SI Appendix, รูปที่ S3) ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีสารตกค้างเหล่านี้มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการจับของนิวคลีโอเบสที่เฉพาะเจาะจงพื้นฐานเชิงโครงสร้างและความสำคัญทางชีวภาพที่เป็นไปได้ของการตั้งค่าพื้นผิวร่วม NTP ที่แตกต่างกันที่สังเกตได้ในโดเมน NiRAN ของโคโรนาไวรัสและไวรัสในหลอดเลือดยังคงต้องศึกษาอาจเป็นจริงหรืออาจเนื่องมาจากข้อจำกัดของการศึกษาที่เกี่ยวข้องในปัจจุบัน ไม่สามารถตัดออกได้ว่ากิจกรรม NMPylator ที่เป็นไปได้ของโดเมน NiRAN ของไวรัสหลอดเลือดแดง (เมื่อเปรียบเทียบกับกิจกรรม NMPylation ของตนเองที่มีลักษณะเฉพาะก่อนหน้านี้) มีการตั้งค่าพื้นผิวร่วมที่แตกต่างกัน โดยคำนึงถึงความคล้ายคลึงกันระหว่างหลอดเลือดแดงและไวรัสโคโรนา โดเมน NiRAN ถึงขีดจำกัดแล้วการเปรียบเทียบตามลำดับ (16)เมื่อเปรียบเทียบกับ pseudokinase SelO ซึ่งใช้ Mg2+ เป็นปัจจัยร่วม กิจกรรมของไวรัสโคโรนาและไวรัสหลอดเลือด NiRAN ขึ้นอยู่กับ Mn2+ (16) (รูปที่ 3C และภาคผนวก SI รูปที่ S1)การพึ่งพา Mn2+ และความชอบที่ชัดเจนสำหรับ UTP เป็นคุณลักษณะที่ผิดปกติของโปรตีน NMPylators และเพิ่งได้รับการยืนยันในโปรตีน YdiU ของ Salmonella typhimurium ซึ่งเร่งปฏิกิริยา UMPylation ของโปรตีนที่ขึ้นกับ Mn2+ ที่เข้มงวดเพื่อปกป้องเซลล์จากการเหนี่ยวนำความเครียด Cell ATP pool ( 33)
ความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างที่อธิบายไว้เมื่อเร็ว ๆ นี้ระหว่างโดเมน coronavirus NiRAN และไคเนสโปรตีนของเซลล์ (17, 19) ให้การสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับความสามารถของ NiRAN ในการเชื่อมโยงโควาเลนต์ NMP กับโปรตีนอื่น ๆ ที่เรารายงานในการศึกษานี้เรามุ่งเน้นการค้นหาเป้าหมาย NiRAN ที่เป็นไปได้บนโปรตีนที่เข้ารหัสโดย HCoV-229E ORF1a ซึ่งเป็นที่รู้กันว่าช่วยเหลือโดยตรงหรือโดยอ้อมในการจำลองแบบจำลองที่เข้ารหัส ORF1b ของ RTC (12, 35)การทดลองของเราเป็นหลักฐานที่แน่ชัดสำหรับ NMPylation ที่มีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจงของ nsp9 (รูปที่ 2)หากใช้โปรตีนเป้าหมายในปริมาณมากเกินกว่าฟันกรามซึ่งสูงกว่าเอนไซม์ (nsp12) 8 ถึง 10 เท่า จะได้รับการยืนยันว่า nsp9 กลายเป็น NMPized (โมโน) อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 4)เราสรุปได้ว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่าง nsp12 และ nsp9 นั้นมีอายุสั้น และจะไม่ก่อให้เกิดคอมเพล็กซ์ที่เสถียรกับ nsp9 (ในกรณีที่ไม่มีหน่วยย่อย RTC อื่น ๆ)ข้อสรุปนี้ได้รับการสนับสนุนจากการศึกษาปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนในโปรตีโอม SARS-CoV (35)การวิเคราะห์ MS ระบุเอมีนปฐมภูมิของ N-terminal ที่ตกค้างของ nsp9 เป็นไซต์ NMPylation (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5)การก่อตัวของพันธะฟอสโฟรามิเดตและหมู่อะมิโนที่ปลาย N แยกความแตกต่างระหว่างกิจกรรม NMPylation ที่ใช้สื่อกลาง NiRAN จากปฏิกิริยา AMPylation ที่ใช้สื่อกลางของ Pseudomonas syringae SelO ซึ่งกระตุ้นการก่อตัวของ AMP ที่เชื่อมโยงกับ O ที่ Ser, Thr หรือ Tyr ตกค้าง Peptide adduct ( 22) และ S. ไทฟิมูเรียม YdiU ก่อรูปแอดดักท์เปปไทด์-UMP ที่เชื่อมโยงกับ O (ที่มี Tyr) และที่เชื่อมโยงกับ N (ด้วย His)ข้อมูลที่จำกัดที่มีอยู่ในตระกูลโปรตีน SelO บ่งชี้ว่าสมาชิกของตระกูลโปรตีนขนาดใหญ่นี้มีความแตกต่างอย่างมากในการสร้าง adducts ของเปปไทด์-NMPนี่เป็นข้อสังเกตที่น่าสนใจและควรค่าแก่การศึกษาเพิ่มเติม
ข้อมูลที่ได้รับในการศึกษานี้ทำให้เราตั้งสมมติฐานว่า NMPylation ของ nsp9 ต้องใช้ N-terminus ฟรีในบริบทของการจำลองแบบของไวรัส สิ่งนี้จะได้มาจากความแตกแยกของโปรตีนของไซต์ประมวลผล nsp8|nsp9 ในการจำลองโพลีโปรตีน pp1a ที่เป็นสื่อกลางโดย Mpro และ pp1abในโคโรนาไวรัสส่วนใหญ่ ความแตกต่างระหว่างตำแหน่งเฉพาะนี้ (VKLQ|NNEI ใน HCoV-229E) และตำแหน่งการแยก Mpro ของไวรัสโคโรนาอื่นๆ ทั้งหมดคือ Asn (แทนที่จะเป็นสิ่งตกค้างเล็กๆ อื่นๆ เช่น Ala, Ser Or Gly) ครอบครอง P1â???ที่ตั้ง (36)ข้อมูลความแตกแยกของเปปไทด์ที่ได้รับในการศึกษาเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพความแตกแยกของตำแหน่ง nsp8|nsp9 นั้นต่ำกว่าของตำแหน่งอื่น ซึ่งบ่งชี้ว่า 1) ตำแหน่งเฉพาะนี้อาจมีบทบาทด้านกฎระเบียบในการประมวลผลที่มีการประสานงานอย่างทันท่วงทีของเทอร์มินัล C ภูมิภาค pp1a หรือ 2) a บทบาทของ nsp9 N-terminus ที่อนุรักษ์ไว้เป็นพิเศษในการจำลองไวรัส (37)ข้อมูลของเรา (รูปที่ 5A) แสดงให้เห็นว่ารูปแบบรีคอมบิแนนท์ของ nsp9 ที่มีลำดับ N-terminal จริงนั้นได้รับการ NMPized อย่างมีประสิทธิภาพโดย nsp12ลำดับขนาบข้างที่ปลาย N ถูกลบออกโดยปัจจัย Xa (nsp9-His6; ภาคผนวก SI, ตาราง S1) หรือความแตกแยกที่ใช้สื่อกลาง Mpro (nsp7-11-His6; รูปที่ 5A และภาคผนวก SI, ตาราง S1)ที่สำคัญสารตั้งต้นที่ประกอบด้วย nsp9 ที่ยังไม่ได้เจียระไน nsp7-11-His6 แสดงให้เห็นความต้านทานต่อ NMPylation ของ nsp12 ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลของเรา ซึ่งบ่งชี้ว่า adduct nsp9-NMP นั้นถูกสร้างขึ้นผ่านเอมีนปฐมภูมิของ N-terminal (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5) .เพื่อให้เข้าใจอย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับความจำเพาะของสารตั้งต้น NiRAN เราจึงมุ่งเน้นไปที่สิ่งตกค้างของ N-terminal ที่อยู่ติดกันของ nsp9ในกรณีที่ไม่มีโปรตีนอื่นๆ โปรตีนเหล่านี้จะมีความยืดหยุ่นเชิงโครงสร้าง ป้องกันไม่ให้ตรวจพบในรูปแบบที่ไม่มีป้ายกำกับของ nsp9 (26 28, 38) ซึ่งบ่งชี้ถึงความแปรผันตามธรรมชาติที่จำกัด นี่เป็นเพราะลำดับเฉพาะที่สำคัญ (ไม่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างรอง) ฟังก์ชั่นของแฟรกเมนต์ N-terminal nsp9การทดแทน Ala ของสารตกค้างอนุรักษ์ในภูมิภาคนี้ (รูปที่ 5C และ D และภาคผนวก SI, รูปที่ S8) เปิดเผยว่า N3826 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ nsp9 NMPylation ในหลอดทดลอง ในขณะที่การทดแทน N3825A และ E3827A ส่งผลให้ NMPylation ลดลง ในขณะที่การทดแทน M3829A และ P3830A ไม่ได้ .ส่งผลต่อ nsp9 NMPylation อย่างเห็นได้ชัดแม้ว่าการทดแทน N-terminal Asn (N3825A, N3825S) มีผลปานกลางต่อ nsp9 NMPylation และการจำลองแบบของไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ (รูปที่ 5C และ D) การลบลำดับ Asn ที่ตกค้างออกจาก N-terminal 3825-NN dipeptide พิสูจน์แล้วว่าเป็นอันตรายถึงชีวิตต่อไวรัส ซึ่งบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมี Asn ตกค้างก่อนที่จะมีสารตกค้างอื่นที่ N-terminus โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Asn แม้ว่าดูเหมือนว่าการทดแทนสารตกค้างที่คล้ายกันสามารถทนได้บางส่วน (รูปที่ 5B, C และ D)เราสรุปได้ว่าไดเปปไทด์ 3825-NN โดยเฉพาะอย่างยิ่งสารตกค้าง N3826 ที่ได้รับการอนุรักษ์และจำเป็นภายในช่วงโคโรนาไวรัส (ภาคผนวก SI, รูปที่ S6) ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการจับและการวางแนวที่ถูกต้องของ nsp9 N-terminus ในบริเวณที่ใช้งานของ NiRAN
การแทนที่ Ala (E3827A) สำหรับ Glu ที่ได้รับการอนุรักษ์ของตระกูลย่อยทั้งหมดยังคงรักษา nsp9 NMPylation ในหลอดทดลอง แต่เป็นอันตรายต่อไวรัสในการเพาะเลี้ยงเซลล์ (รูปที่ 5C และ D) ซึ่งบ่งบอกถึงการทำงานเพิ่มเติมของสารตกค้างนี้ เช่น ในการโต้ตอบที่สำคัญ (NMPylated หรือไม่ได้แก้ไข ) nsp9 N-terminus และปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการจำลองแบบของไวรัสการกลายพันธุ์ของ Nsp9 ไม่ส่งผลกระทบต่อกระบวนการโปรตีโอไลติกของ nsp9 หรือ nsps ใด ๆ ที่อยู่ติดกัน (39) (SI ภาคผนวก, รูปที่ S9) ซึ่งบ่งชี้ว่าฟีโนไทป์ที่ร้ายแรงของการกลายพันธุ์ของ nsp9 หลายอย่างที่สังเกตไม่ได้เกิดจากการควบคุมที่ผิดปกติของพื้นที่ pp1a ของกระบวนการโปรตีโอไลติกของ C proteolytic .
ข้อมูลข้างต้นแสดงหลักฐานว่าหลังจากการรักษาโดยอาศัย Mpro ของบริเวณรอยแยก nsp8 | 9 ใน pp1a/pp1ab แล้ว ปลายทาง N ของ nsp9 สามารถ UMPylated ได้ (หรือแก้ไขบางส่วนด้วย NMP อื่น)นอกจากนี้ การอนุรักษ์ N-terminus ของ nsp9 ได้อย่างยอดเยี่ยม (รวมถึง Asn ที่ตกค้างเอกพจน์และไม่แปรผันในตระกูลโคโรนาไวรัส) และข้อมูลพันธุกรรมย้อนกลับที่ได้รับในการศึกษานี้ (รูปที่ 3E และ 5D) ทำให้เราสรุปได้ว่า nsp9 NMPylation ที่อธิบายไว้ มีความสัมพันธ์ทางชีวภาพและจำเป็นต่อการจำลองแบบของไวรัสโคโรนาผลที่ตามมาจากการทำงานของการปรับเปลี่ยนนี้ยังคงมีการศึกษา ตัวอย่างเช่น เกี่ยวกับกิจกรรมการเชื่อมโยง RNA ของ nsp9 (รูปแบบที่ไม่ได้แก้ไข) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2628)N-terminal NMPylation อาจส่งผลต่อการทำงานร่วมกันของ nsp9 กับโปรตีนหรือสารตั้งต้น RNA หรือการก่อตัวของชุดประกอบสี่ระดับที่แตกต่างกันสิ่งเหล่านี้ได้รับการสังเกตในการศึกษาเชิงโครงสร้าง และได้รับการยืนยันแล้วว่าเกี่ยวข้องกับการใช้งานของการจำลองแบบของไวรัสโคโรนา แม้ว่าโดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงนี้ (26-ââ29, 40)
แม้ว่าความจำเพาะของเป้าหมายของโดเมน coronavirus NiRAN ยังคงต้องมีการระบุลักษณะโดยละเอียดมากขึ้น แต่ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าความจำเพาะของเป้าหมายโปรตีนของโดเมน NiRAN ของไวรัสโคโรนานั้นแคบมากแม้ว่าการอนุรักษ์สิ่งตกค้างจากไซต์แอคทีฟที่สำคัญ (8, 16) ในโดเมน NiRAN ของตระกูล nidovirus ทั้งหมดสนับสนุนกิจกรรมของ NMPylator ที่ได้รับการอนุรักษ์โปรตีนเหล่านี้อย่างมาก แต่เอกลักษณ์ของสารตั้งต้นที่มีผลผูกพันกับกระเป๋าที่ตกค้างของโดเมนนี้ การอนุรักษ์และการอนุรักษ์ยังคงมีลักษณะเฉพาะ และอาจแตกต่างกันไปตามกลุ่มวัตถุประสงค์ของ Nidoviralesในทำนองเดียวกัน ยังไม่ได้กำหนดเป้าหมายที่เกี่ยวข้องของไวรัสที่ซ้อนกันอื่นๆพวกมันอาจเป็นออร์โธโลจีระยะไกลของ nsp9 หรือโปรตีนอื่น ๆ เนื่องจากลำดับภายนอกโดเมนเรพลิกาห้าโดเมนที่โดยทั่วไปได้รับการอนุรักษ์ในไวรัสที่ซ้อนกันนั้นได้รับการอนุรักษ์น้อยกว่า (8) รวมถึงอาร์เรย์จีโนมระหว่าง Mpro และ NiRAN ในหมู่พวกเขา nsp9 ตั้งอยู่ใน ไวรัสโคโรน่า.
นอกจากนี้ ขณะนี้เราไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ที่โดเมน NiRAN จะมีเป้าหมายเพิ่มเติม (รวมถึงโทรศัพท์มือถือ)ในกรณีนี้ เป็นที่น่าสังเกตว่าความคล้ายคลึงของแบคทีเรียในโปรตีน NMPylators (NMPylators) (30, 31) ที่เกิดขึ้นใหม่นี้ดูเหมือนจะมี "ตัวควบคุมหลัก" หรือไม่NMP ปรับโปรตีนของเซลล์หลายชนิดเพื่อควบคุมหรือกำจัดกิจกรรมปลายน้ำ ดังนั้นจึงมีบทบาทในกระบวนการทางชีวภาพที่หลากหลาย เช่น การตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์และสภาวะสมดุลรีดอกซ์ (22, 33)
ในการศึกษานี้ (รูปที่ 2 และ 4 และภาคผนวก SI, รูปที่ S3 และ S5) เราสามารถพิสูจน์ได้ว่า nsp12 ถ่ายโอนส่วน UMP (NMP) ไปยังตำแหน่งเดียว (อนุรักษ์) ใน nsp9 ในขณะที่โปรตีนอื่นๆ ไม่ได้ถูกดัดแปลงใน ใช้ภายใต้เงื่อนไข รองรับความจำเพาะของวัสดุพิมพ์ที่กำหนดไว้อย่างดี (แทนที่จะหลวม)สอดคล้องกับสิ่งนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับ N-terminal nsp9 NMPylation กิจกรรม NMPylation ของ nsp12 เองนั้นต่ำมาก การตรวจจับต้องใช้เวลาในการเปิดรับแสงอัตโนมัตินานขึ้น และใช้ความเข้มข้น nsp12 เพิ่มขึ้น 10 เท่านอกจากนี้การวิเคราะห์ MS ของเราล้มเหลวในการให้หลักฐานสำหรับ NMPylation ของ nsp12 ซึ่งชี้ให้เห็นว่าโดเมน NiRAN ด้วยตนเอง NMPylation เป็นกิจกรรมรอง (อย่างดีที่สุด)อย่างไรก็ตามควรสังเกตว่าการศึกษาอื่น ๆ ได้ให้หลักฐานเบื้องต้นว่าสถานะ AMPylation ของตนเองของแบคทีเรีย NMPylator อาจควบคุมกิจกรรม NMPylation บนพื้นผิวโปรตีนอื่น ๆ (22, 33)ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบผลกระทบการทำงานที่เป็นไปได้ของกิจกรรม NMPylation ด้วยตนเองที่รายงานสำหรับ EAV nsp9 (16) และ coronavirus nsp12 (การศึกษานี้) รวมถึงผลกระทบที่คล้ายกับพี่เลี้ยงที่เสนอต่อการพับของโดเมน C-terminal RdRp ( 16) ).
ก่อนหน้านี้ มีการพิจารณาสมมติฐานหลายประการเกี่ยวกับฟังก์ชันดาวน์สตรีมที่เป็นไปได้ของโดเมน nidoviral NiRAN ซึ่งรวมถึง RNA ligase, RNA -capped guanylate Transferase และกิจกรรมการเตรียมโปรตีน (16) แต่ไม่มีข้อใดที่เข้ากันได้กับฟังก์ชันดาวน์สตรีมที่มีอยู่ข้อมูลที่ได้รับในตำแหน่งต่อไปนี้เป็นเวลาเดียวกันทุกประการโดยไม่ต้องตั้งสมมติฐานเพิ่มเติมข้อมูลที่ได้รับในการศึกษานี้สอดคล้องมากที่สุด (แต่ไม่สามารถพิสูจน์ได้) ว่าโดเมน NiRAN เกี่ยวข้องกับการเริ่มต้นการสังเคราะห์ RNA ที่เกิดจากโปรตีนก่อนหน้านี้เชื่อกันว่าการทำงานของโดเมน NiRAN ใน 5??²-RNA capping หรือปฏิกิริยา RNA ligation ไม่ได้รับผลกระทบจากสิ่งเหล่านี้และการสนับสนุนข้อมูลอื่น ๆดังนั้น ตัวอย่างเช่น ตำแหน่งที่ใช้งานอยู่ของ NiRAN ถือว่าเกี่ยวข้องกับ Asp ที่อนุรักษ์ไว้เป็นฐานทั่วไป (D252 ใน Pseudomonas syringae SelO; D4271 ใน HCoV-229E pp1ab; D208 ใน SARS-CoV-2 nsp12) (SI ภาคผนวก รูปที่ 2 ).S2) (17, 22, 33) ในขณะที่การเร่งปฏิกิริยาใน RNA ligase ที่ขึ้นกับ ATP และเอนไซม์การจำกัด RNA ดำเนินการโดยเอนไซม์โควาเลนต์-(ไลซิล-N)-NMP สารมัธยันตร์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับเรซิดิว Lys ที่ไม่เปลี่ยนแปลง ( 41)นอกจากนี้ ความจำเพาะตามลำดับที่น่าทึ่งของ coronavirus NiRAN สำหรับเป้าหมายโปรตีนที่ได้รับการอนุรักษ์ และความจำเพาะที่ผ่อนคลายสำหรับสารตั้งต้นร่วม NTP (ชอบ UTP) จะตรงข้ามกับเอนไซม์ capping ที่ใช้สื่อกลาง NiRAN หรือฟังก์ชันคล้าย RNA ligase
เห็นได้ชัดว่าจำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติมจำนวนมากในการตรวจสอบ และหากได้รับการพิสูจน์แล้ว ให้อธิบายรายละเอียดเกี่ยวกับบทบาทที่เป็นไปได้ของ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ในการสังเคราะห์ RNA ที่เกิดจากโปรตีน ซึ่งจะเชื่อมโยงรายงานที่น่าสนใจหลายฉบับ แต่ (จนถึงตอนนี้) ที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ .ข้อสังเกตที่แยกจากกันตัวอย่างเช่น มีการพิจารณาแล้วว่าส่วนปลายของ RNA สายลบของไวรัสโคโรนาเริ่มต้นด้วยสายโอลิโก (U) (42, 43)การสังเกตนี้สอดคล้องกับแนวคิดที่ว่าการสังเคราะห์ RNA สายลบเริ่มต้นโดยการเชื่อมโยงรูปแบบ UMPylated ของ nsp9 กับส่วนท้ายของโพลี (A) (ทริกเกอร์) ซึ่งอาจได้รับการส่งเสริมโดยการจับ RNA ของมัน กิจกรรมและ/หรือปฏิสัมพันธ์กับ โปรตีน RTC อีกชนิดหนึ่งส่วน UMP ที่จัดทำโดย nsp9 สามารถใช้เป็น "ไพรเมอร์" สำหรับ oligouridylation ที่ใช้สื่อกลาง nsp7/8/nsp12 โดยใช้ส่วนท้าย 3??²-poly(A) ในจีโนม RNA หรือลำดับที่ประกอบด้วยโอลิโก (A) อื่น ทำหน้าที่เป็นเทมเพลต คล้ายกับกลไกที่สร้างขึ้นสำหรับโปรตีน picornavirus VPg (44)จะเกิดอะไรขึ้นหากข้อเสนอนั้น "ไม่ใช่บรรทัดฐาน"????การเริ่มต้นของการสังเคราะห์ RNA สายเชิงลบ (ที่เกิดจากโปรตีน) ทำให้เกิดการเชื่อมโยงกับข้อสังเกต ซึ่งบ่งชี้ว่า RNA สายเชิงลบของไวรัสโคโรนามี UMP (แทนที่จะเป็น UTP) ที่ส่วนท้าย (42) ซึ่งถือว่าบ่งชี้ว่า กรดนิวคลีอิก Dicer จะแยกส่วนปลายของฟอสโฟรีเลชั่นโดยเอนโดนิวคลีเอสที่จำเพาะต่อยูริดีนที่ไม่รู้จักหากได้รับการยืนยัน ฤทธิ์ไฮโดรไลติกของกรดนิวคลีอิกนี้สามารถช่วยปลดปล่อยรูปแบบ UMPylated โอลิโกเมอริกของ nsp9 ออกจากปลาย 5 ² ของเกลียวลบที่เพิ่งเกิดใหม่บทบาทที่เป็นไปได้ของ nsp9 ในการเตรียมโปรตีนยังสอดคล้องกับการศึกษาทางพันธุศาสตร์ย้อนกลับก่อนหน้านี้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่า nsp9 (และ nsp8) มีปฏิกิริยาโต้ตอบอย่างมีวิจารณญาณและโดยเฉพาะกับองค์ประกอบ RNA ที่ออกฤทธิ์ถูกต้องที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ใกล้กับปลายที่ 3 ของจีโนมของไวรัสโคโรนา45)ตามรายงานนี้ ข้อสังเกตก่อนหน้านี้สามารถตรวจสอบซ้ำและขยายผลผ่านการวิจัยเพิ่มเติมได้
โดยสรุป ข้อมูลของเรากำหนดกิจกรรมเฉพาะของแท็กเอนไซม์ไวรัสที่ซ้อนกันที่เป็นกรรมสิทธิ์ซึ่งเชื่อมโยงกับ RdRp ที่ปลายทาง Nในไวรัสโคโรนา กิจกรรม UMPylator/NMPylator ที่ใช้สื่อกลาง NiRAN ที่เพิ่งค้นพบนี้ใช้ในการพึ่งพา Mn2+ และสารตกค้าง Asn ที่อยู่ติดกัน และทำให้เกิดการก่อตัวของพันธะฟอสโฟรามิเดต (พลังงานต่ำ) กับเอมีนปฐมภูมิที่ปลาย Nผ่านความแตกแยกที่ใช้สื่อกลาง Mpro ที่ไซต์ความแตกแยก nsp8 | 9 เป้าหมาย nsp9 สามารถใช้สำหรับ NMPylation ได้ ซึ่งบ่งชี้ถึงการทำงานร่วมกันระหว่างโปรตีเอสและโดเมน NiRAN ซึ่งขยายไปถึง RdRpการอนุรักษ์สารตกค้างที่สำคัญในบริเวณที่มีการใช้งาน nsp12 NiRAN และเป้าหมาย nsp9 รวมกับข้อมูลที่ได้รับจากโคโรนาไวรัส 2 ชนิด รวมถึง SARS-CoV-2 ให้หลักฐานที่ชัดเจนว่า nsp9 NMPylation เป็นคุณสมบัติแบบอนุรักษ์นิยมของโคโรนาไวรัส ยังเป็นขั้นตอนสำคัญในการจำลองไวรัสข้อมูลที่มีอยู่ทำให้เราสรุปได้ว่าบทบาทเฉพาะของรูปแบบ NMPylated ของ nsp9 ในการสังเคราะห์ RNA ที่เกิดจากโปรตีนเป็นสถานการณ์ที่สมเหตุสมผลสำหรับโคโรนาไวรัสและไวรัสที่ซ้อนกันอื่น ๆ และ NiRAN อาจกำหนดเป้าหมายไปที่โปรตีนที่ไม่ปรากฏชื่ออื่น ๆควบคุมไวรัสการโต้ตอบกับโฮสต์หากได้รับการยืนยัน การมีส่วนร่วมของไพรเมอร์โปรตีนในการสังเคราะห์ RNA ของไวรัสจะเพิ่มความสัมพันธ์ของลำดับของโดเมน Mpro/3CLpro และ RdRp ระหว่างไวรัสโคโรนาที่ตรวจพบก่อนหน้านี้และกลุ่มซุปเปอร์กรุ๊ปที่มีลักษณะคล้าย picornavirus (9) ซึ่งขณะนี้ได้รวมเป็นหนึ่งเดียวใน Pisonivirites ที่จัดตั้งขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้ ( 46) ในหมวดหมู่
ข้อมูลของเรายังแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมของเอนไซม์พื้นฐาน คัดเลือก และอนุรักษ์ที่ระบุในการศึกษานี้สามารถใช้เป็นเป้าหมายสำหรับยาต้านไวรัสได้สารประกอบที่รบกวนการจับตัว (และการดัดแปลงในภายหลัง) ของปลาย Nsp9 ที่ได้รับการอนุรักษ์ในบริเวณที่ออกฤทธิ์ของ NiRAN สามารถพัฒนาเป็นยาต้านไวรัสที่มีประสิทธิภาพและใช้งานได้หลากหลาย เหมาะสำหรับการรักษาโคโรน่าไวรัสในสัตว์และในมนุษย์จากการติดเชื้อในสกุลต่างๆ (ย่อย) รวมถึง SARS-CoV-2 และโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจตะวันออกกลาง
ลำดับการเข้ารหัสของโปรตีนไวรัสโคโรนาที่ผลิตในการศึกษานี้ขยายโดย RT-PCR โดยใช้ RNA ที่แยกได้จาก Huh-7 ที่ติดเชื้อ HCoV-229E หรือ Vero E6 ที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2 และแทรกโดยใช้ขั้นตอนการโคลนมาตรฐานpMAL-c2 (ห้องปฏิบัติการชีววิทยานิวอิงแลนด์) หรือเวกเตอร์นิพจน์ pASK3-Ub-CHis6 (47) (SI ภาคผนวก, ตาราง S1 และ S2)การทดแทนโคดอนเดี่ยวถูกนำมาใช้โดยการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์โดยใช้ PCR (48)ในการผลิตโปรตีนฟิวชั่น MBP เซลล์ E. coli TB1 ถูกเปลี่ยนด้วยโครงสร้างพลาสมิด pMAL-c2 ที่เหมาะสม (ภาคผนวก SI, ตาราง S1)ฟิวชันโปรตีนถูกทำให้บริสุทธิ์โดยอะมิโลสอัฟฟินิตี้โครมาโทกราฟีและตัดแยกด้วยแฟคเตอร์ Xaต่อจากนั้นโปรตีนที่ติดแท็ก His6 ของ C-terminal ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโตกราฟีความสัมพันธ์ของโลหะที่ตรึงด้วย Ni (Ni-IMAC) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (49)ในการผลิตโปรตีนฟิวชั่น ubiquitin เซลล์ E. coli TB1 ใช้โครงสร้างพลาสมิด pASK3-Ub-CHis6 ที่เหมาะสม (SI ภาคผนวก, ตาราง S1 และ S2) และ pCGI plasmid DNA ที่เข้ารหัส C-terminal hydrolase 1 เฉพาะของ ubiquitin (Ubp1)การเปลี่ยนแปลง (47)โปรตีนโคโรนาไวรัสที่ติดแท็ก His6 ที่เทอร์มินัล C ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (50)
การทดสอบ NMPylation ด้วยตนเองของ HCoV-229E nsp12-His6 ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน EAV nsp9 (16)โดยสรุป nsp12-His6 (0.5 µM) มีกรด 4-(2-ไฮดรอกซีเอทิล)-1-พิเพอราซีนอีเทนซัลโฟนิก (HEPES)-KOH 50 มิลลิโมลาร์ 4-(2-ไฮดรอกซีเอทิล)-KOH, pH 8.0, ไดไทโอไทรทอล 5 มิลลิโมลาร์ (DTT), 6 มิลลิโมลาร์ MnCl2, บัฟเฟอร์ 25 ไมโครโมลาร์, ฟักตัว NTP ที่ระบุและ 0.17 µM จับคู่ [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ที่ 30 °C เป็นเวลา 30 นาทีในการตรวจ NMPylation อื่นๆ (มาตรฐาน) ของ NSP12-mediated nsp9 NMPylation เงื่อนไขของปฏิกิริยาจะถูกปรับดังนี้: nsp12-His6 (0.05 µM) และ nsp9-His6 (4 µM) โดยมี HEPES-KOH 50 mM (pH 8.0) ), 5 มิลลิโมลาร์ DTT, 1 มิลลิโมลาร์ MnCl2, 25 ไมโครโมลาร์ที่ระบุ NTP และ 0.17 ไมโครโมลาร์ที่จับคู่ [α32-P]NTPหลังจากการบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 30°C ตัวอย่างปฏิกิริยาถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS-PAGE: 62.5 มิลลิโมลาร์ ทริส(ไฮดรอกซีเมทิล)อะมิโนมีเทน HCl (pH 6.8), 100 มิลลิโมลาร์ DTT, 2.5% SDS, 10% กลีเซอรอลและ 0.005% โบรโมฟีนอล สีฟ้า.โปรตีนถูกทำให้เสียสภาพโดยการให้ความร้อนที่ 90 °C เป็นเวลา 5 นาทีและแยกจากกันโดย 12% SDS-PAGEเจลได้รับการแก้ไขและย้อมด้วยสารละลาย Coomassie Brilliant Blue (เมทานอล 40%, กรดอะซิติก 10%, Coomassie Brilliant Blue R-250 0.05%) ปรับสีออก และสัมผัสกับหน้าจอถ่ายภาพเรืองแสงเป็นเวลา 20 ชั่วโมง (เพื่อตรวจจับ nsp12 จาก NMPylation) หรือ (สูงสุด) 2 ชั่วโมง (เพื่อประเมิน nsp9 NMPylation)มีการใช้อิมเมจ Typhoon 9200 (GE Healthcare) เพื่อสแกนหน้าจอ และใช้ ImageJ เพื่อวิเคราะห์ความเข้มของสัญญาณ
สำหรับการวิเคราะห์ MS จะใช้ 1 µM nsp12-His6 และ 10 µM nsp9 (ไม่มีแท็กเฮกซาฮิสทิดีน) ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ NMPylation (ภาคผนวก SI, ตาราง S1) และใช้ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น 500 µM UTP และ GTPขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและคุณภาพโปรตีนที่คาดหวัง ระบบ Waters ACQUITY H-Class HPLC ที่ติดตั้งคอลัมน์ MassPrep (น้ำ) ถูกนำมาใช้เพื่อแยกเกลือของสารละลายโปรตีนบัฟเฟอร์ 1 ถึง 10 ไมโครลิตรทางออนไลน์โปรตีนที่แยกเกลือแล้วจะถูกชะออกไปในแหล่งกำเนิดไอออนสเปรย์ด้วยไฟฟ้าของแมสสเปกโตรมิเตอร์ Synapt G2Si (น้ำ) ผ่านการไล่ระดับต่อไปนี้ของบัฟเฟอร์ A (น้ำ/กรดฟอร์มิก 0.05%) และบัฟเฟอร์ B (อะซีโตไนไตรล์/กรดฟอร์มิก 0.045%) และอุณหภูมิของคอลัมน์คือ 60 ° C และอัตราการไหล 0.1 มล./นาที: ชะแบบไอโซแครตด้วย 5% A เป็นเวลา 2 นาที จากนั้นไล่ระดับเชิงเส้นเป็น 95% B ภายใน 8 นาที และคงระดับ 95% B ไว้อีก 4 นาที
ตรวจพบไอออนบวกที่มีช่วงมวล 500 ถึง 5,000 m/zกลู-ไฟบริโนเปปไทด์ B ถูกวัดทุกๆ 45 วินาทีเพื่อแก้ไขการเคลื่อนตัวของมวลอัตโนมัติใช้ซอฟต์แวร์เครื่องมือ MassLynx พร้อมส่วนขยาย MaxEnt1 เพื่อแยกส่วนสเปกตรัมเฉลี่ยหลังจากหักค่าพื้นฐานและทำให้เรียบแล้ว
HCoV-229E nsp9 ที่ถูก UMPylated ถูกย่อยโดยการเติมทริปซินที่ผ่านการดัดแปลงระดับลำดับ (Serva) และบ่มข้ามคืนที่ 37 °Cคอลัมน์หมุน Chromabond C18WP (หมายเลขชิ้นส่วน 730522; Macherey-Nagel) ถูกนำมาใช้เพื่อแยกเกลือและทำให้เปปไทด์เข้มข้นสุดท้าย เปปไทด์ถูกละลายในน้ำ 25 ไมโครลิตร ซึ่งมีอะซิโตไนไตรล์ 5% และกรดฟอร์มิก 0.1%
ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดย MS โดยใช้เครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวล Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific)สุดยอดระบบ nanoâ HPLC (Dionex) ที่มาพร้อมกับส่วนปลายแบบกำหนดเองขนาด 50 ซม.??คอลัมน์ C18 RP ขนาด 75 μm บรรจุด้วยเม็ดแม่เหล็ก 2.4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) เชื่อมต่อกับแมสสเปกโตรมิเตอร์ออนไลน์ผ่านแหล่งสเปรย์นาโน Proxeonฉีดสารละลายย่อยทริปซิน 6 µL เข้าไปในเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 300 µm ×1 ซม. C18 PepMap คอลัมน์เตรียมความเข้มข้นล่วงหน้า (Thermo Scientific)โดยใช้น้ำ/กรดฟอร์มิก 0.05% เป็นตัวทำละลาย ตัวอย่างจะถูกกักและแยกเกลือออกโดยอัตโนมัติที่อัตราการไหล 6 ไมโครลิตร/นาที
การไล่ระดับต่อไปนี้ของน้ำ/กรดฟอร์มิก 0.05% (ตัวทำละลาย A) และ 80% อะซีโตไนไตรล์/กรดฟอร์มิก 0.045% (ตัวทำละลาย B) ถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้มาซึ่งการแยกทริปเปปไทด์เปปไทด์ที่อัตราการไหล 300 นาโนลิตร/นาที: 4% B สำหรับ 5 นาที จากนั้น 30 A เกรเดียนต์เชิงเส้นถึง 45% B ภายในไม่กี่นาที และเพิ่มเชิงเส้นเป็นตัวทำละลาย B 95% ภายใน 5 นาทีเชื่อมต่อคอลัมน์โครมาโตกราฟีกับตัวปล่อยนาโนที่เป็นสเตนเลสสตีล (Proxeon) และฉีดสารชะโดยตรงไปยังเส้นเลือดฝอยที่ให้ความร้อนของแมสสเปกโตรมิเตอร์โดยใช้ศักย์ไฟฟ้า 2,300 V การสแกนแบบสำรวจด้วยความละเอียด 60,000 ในเครื่องวิเคราะห์มวล Orbitrap มีความเกี่ยวข้องกัน ด้วยการสแกน MS/MS ข้อมูลอย่างน้อยสามครั้ง ยกเว้นแบบไดนามิกเป็นเวลา 30 วินาที โดยใช้การแยกตัวที่เหนี่ยวนำให้เกิดการชนกันของไอออนกับดักเชิงเส้น หรือการแยกตัวของพลังงานที่สูงกว่าเมื่อรวมกับการตรวจจับวงโคจร ความละเอียดคือ 7,500
เวลาโพสต์: Aug-03-2021